Саймон был четвёртым из девяти детей в семье. Среди его младших братьев - Эйбрахам Флекснер (1866-1959), реформатор преподавания медицины в США, основатель Института перспективных исследований в Принстоне, и Бернард Флекснер (1882-1946), известный нью-йоркский адвокат и видный деятель Сионистской организации Америки. В 1973г. их отец обанкротился. Саймон бросил школу в шестом классе, перебивался случайными заработками.

   Перелом в его поведении произошёл в 16-летнем возрасте, после того как он едва не умер от тифа. Он получил постоянную работу в аптеке, окончил с отличием Луисвилльский фармацевтический колледж. Позже Саймон получил докторскую степень в Луисвилльском университете и следующие 14 лет работал в Университете "Джонс Хопкинс" в Балтиморе, пройдя путь от ассистента до профессора. Основным направлением его работы было изучение проблем патологии.

    Флекснер участвовал в борьбе со многими эпидемиями, начиная с эпидемии менингита в западном Мэриленде (1893). В 1899г. он отправился на Филиппины, где вспыхнула эпидемия сразу нескольких инфекционных заболеваний. Там он, в частности, выделил бактерию - возбудителя тропической дизентерии, которая была названа его именем - Shigella flexneri.

   Когда в 1901г. в Нью-Йорке был создан Рокфеллеровский институт медицинских исследований, первое подобное учреждение в США,  Флекснер был избран его директором и одним из семи членов Учёного совета. Ему было поручено руководить всеми лабораториями Института.

     В 1905г. во время страшной эпидемии спинномозгового менингита в Нью-Йорке Флекснер, экспериментируя с обезьянами, сумел создать сыворотку для борьбы с этой болезнью. Он внёс важный вклад в изучение полиомиелита во время вспышки этой болезни в восточных штатах в 1907г., хотя вакцина от полиомиелита была создана только 40 лет спустя.

     В течение 19 лет Флекснер был редактором "Журнала экспериментальной медицины". Во время Первой мировой войны он служил в Медицинском корпусе армии США в чине подполковника, организовывал и инспектировал медицинские подразделения экспедиционных сил в Европе. После войны продолжал работать в Рокфеллеровском университете и в отделении патологии животных в Принстоне - до 1935г.